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沙门氏菌检测(全文完整)
文章来源:http://www.songfengkou.com/  2013年06月15日  点击数:5405

沙门氏菌检测(全文完整

一、检测方法
 
检测步骤
  1. 前增菌和增菌。冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌,各称取检样25g,加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器,以8000~10000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎;粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化,于36±1℃培养4h(干蛋品需培养18~24h),移取10mL,转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内,于42℃培养18~24h。同时另取10mL,加入于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内,于36±1℃培养18~24h。
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL),加入灭菌生理盐水25mL,按前法做成检样匀液,取其半量接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内,于42℃培养24h;另半量接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内,于36±1℃培养18~24h。
    2. 分离。取增菌液1环,划线接种于亚硫酸铋琼脂平板和DHL琼脂平板(或HE、WS、SS琼脂平板)各一个。于36±1℃分别培养18~24h(DHL、HE、WS、SS)或40~48h(BS)。观察各个平板上生长的菌落。其菌落特征见表3-1。
挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落,接种三糖铁琼脂斜面,一般应多挑几个菌落,以防遗漏,沙门氏菌在三糖铁琼脂上与肠杆菌科各属可疑反应的鉴别见表3~2。
    3. 生化学鉴定。在接种三糖铁琼脂的同时,再接种蛋白胨水(供靛基质试验用),尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管,于36±1℃培养18~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果,如遇有非典型菌株,可根据情况补做有关生物化学试验,必要时进行各亚属的鉴定。
    4. 血清学分型。一般采用1.5%琼脂斜面培养物做玻片凝集试验。
(1)O抗原的鉴定:首选用A~F多价血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水作对照,生理盐水自凝者不能分型。凡A~F多价血清呈现凝集者,可依次用O因子血清进行凝集试验,根据结果判定O群。如不被A~F多价O血清凝集者,可用57种或163种沙门氏菌因子血清中的7种多价血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清包括的O群血清逐一检查,以确定O群。如果由于Vi抗原存在而阻止O凝集时,可将菌苔用生理盐水作成浓菌液煮沸后再检查。
(2)H抗原的鉴定。根据所确定的O群,依次用H因子血清检查1相和2相的H抗原,对不常见的菌型,可先用多价H血清检查,如其中某种多价血清凝集时,则再用此血清所包括的H因子血清逐一检查,以确定第1相和第2相的H抗原,如无单因子血清时,要用两个H复合因子血清核对其检查的结果。如仅检出第1相或第2相时,可在琼脂斜面上移种1~2代后再检查,若仍为一相,要用位相变异的方法检查其另一相H抗原。
常用的位相变异试验方法如下:
小套管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出培养基的表面,灭菌备用。溶化琼脂冷至50℃时,挑取已知H因子血清1环,加入套管中的琼脂表面,于37℃培养,每日观察,另一相解离后可由套管外的半固体表面取菌检查。
U型管法:向0.4%琼脂培养基中加入适量血清,装入灭菌U形管内,管口塞棉塞,凝固后由一端接种细菌,经培养再由另一端取菌检查。
简易平板法:将0.7%~0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检细菌,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
(3)Vi抗原的鉴定:用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。
5. 菌型的判定和结果报告。综合以上生化试验和血清学分型鉴别的结果,按照沙门氏菌属抗原表判定菌型,并报告结果。



二、结果分析判定及注意事项
  (一)培养特性
沙门氏菌为需氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌,有动力,有周鞭毛(但有无动力的变种),能在普通培养基上生长良好,最适温度为37℃,最适pH为7.2~7.6,在固体培养基上37℃ 24h菌落可呈中等大小,光滑,圆形,湿润,隆起,在液体培养基内生长均匀混浊。
在检品中,沙门氏菌含量较少或食品加工过程中使其受到损伤而处于濒死的状态时,为了能够分离出沙门氏菌,需要选用增菌培养的办法,如冻冷食品和加工食品必须经过前增菌,使检品中的沙门氏菌恢复其活力,对未经加工的和鲜食品,不必进行前增菌,可用选择性增菌培养,使沙门氏菌得以增值,而使大多数的其他细菌受到抑制,再进行分离,可以提高沙门氏菌的检出率。
采用选择性琼脂平板分离沙门氏菌时,经37℃分别培养18~24h(DHL、HE、WS、SS)或40~48h(BS),各个平板上的菌落特征见表3-1。

表3-1 沙门氏菌属各亚属在各种选择性琼脂
平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ
亚属Ⅲ(即亚利桑那菌)
亚硫酸铋琼脂
 产硫化氢的菌落为黑色,有金属光泽,棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色,有些菌株不产生硫化氢,形成灰绿色的菌落,周围培养基不变
黑色有色光泽
dhl琼脂
 无色半透明,产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色
 乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同;乳糖阳性的菌株为粉红色,中心带黑色
he琼脂 ws琼脂
 蓝绿色或蓝色;多数菌株产硫化氢,菌落中心黑色或几乎全黑色
 乳糖阳性的菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色;乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色,中心黑色或几乎全黑色
ss琼脂
 无色半透明;产硫化氢菌株,有的菌落中心带黑色,但不如以上培养基明显
 乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同;乳糖阳性的菌株为粉红色,中心黑色,但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别

(二)生化性状


表3-3 肠杆菌科各属生化反应初步鉴别


硫化氢 (h2s)
靛基质
尿素
(ph7.2)
氰化钾
(kcn)
赖氨酸脱
羧酶
判 定 菌 属
+
沙门氏菌属
+
+
沙门氏菌属(少见),爱德华氏菌属
+
+
+
柠檬酸杆菌属,奇异变形杆菌
+
+
+
+
普通变形杆菌




+
沙门氏菌属,埃希氏首属
甲型副伤寒沙门氏菌,埃希氏菌属,志贺氏菌属

+
+


+
埃希氏菌属
埃希氏菌属,志贺氏菌属


+/- +
+
+
+
克雷伯民族各属
阴沟肠杆菌柠檬酸杆菌量
+
+/-
+
莫尔根氏菌量,普罗菲登斯菌属


注:① 三糖铁琼脂底层均应产酸,不产酸者可排除,斜面产酸与产气与否均不限。
  ② KCN和赖氨酸可选用其中一项,但不能判定结果时,仍需补做另一项。
  ③ +表示阳性,-表示阴性,+/-表示多数阳性,少数阴性。
如尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项或两项异常者,可按表3-4判定。如生化反应可疑而A~F多价O血清不凝集时,可补做甘露醇和山梨醇,按表3-5判定。必要时可按表3-7进行沙门氏菌属各生化群的鉴别。
表3-4


尿素
(ph7.2)
氰化钾
(kcn)
赖氨酸
判 定 结 果


+

+
- 

+
+
 
甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)
沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)
沙门氏菌个别变种(要求血清学鉴定结果)


表3-5


甘露醇
山梨醇
判 定 结 果
+
+
沙门氏菌属靛基质阳性变种(要求血清学鉴定结果)
爱德华氏菌属


 
表3-6


赖氨酸
鸟氨酸
onpg
水杨苷
棉子糖
动力
判定结果
+


d
+

+
d


+
d



d



d
+


d
沙门氏菌属
志贺氏菌属
宋内氏志贺氏菌
埃希氏菌属


注:① +表示阳性;-表示阴性;d表示有不同反应。
   ② 伤寒沙门氏菌鸟氨酸阴性,甲型副伤寒沙门氏菌赖氨酸阴性,鸡沙门氏菌无动
力。如果未做氰化钾试验时,常需做V-P试验(22~25℃,4d)哈夫尼亚菌属
为阳性。

表3-7


项目
卫矛醇
山梨醇
水杨苷
onpg
丙二酸盐
kcn
+
+



+
+


+

+

+
+

+
+


+
+
+

+

+







(三)血清学分型
根据血清学鉴定的结果,查阅沙门氏菌属抗原表判定菌型(表2-8)。
菌 名
原 名
O抗原
h抗原
 
第1相
第2相
 
 
 
a  群
 
 
 
 
甲型副伤寒沙门氏菌
s.paratyphi a
1,2,12
a
[1,5]
b  群
 
 
 
 
基桑加尼沙门氏菌
s.kisangani
1,4,[5],12
a
1,2
阿雷查瓦莱塔沙门氏菌
s.arechavaleta
4,[5],12
a
[1,7]
马流产沙门氏菌
s.abortus equi
4,12
e,n,x
乙型副伤寒沙门氏菌
s.paratyphi
1,4,[5],12
b
1,2
利密特沙门氏菌
b s.limete
1,4,12,27
b
1,5
阿邦尼沙门氏菌
s.abony
1,4,[5],12,27
b
e,n,x
维也纳沙门氏菌
s.wien
1,4,12,27
b
l,w
伯里沙门氏菌
s.bury
4,12,27
c
z6
斯坦利沙门氏菌
s.stanley
1,4,[5],12,27
d
1,2
圣保罗沙门氏菌
s.saint paul
1,4,[5],12
e,h
1,2
里定沙门氏菌
s.reading
1,4,[5],12
e,h
1,5
彻斯特沙门氏菌
s.chester
1,4,[5],12
e,h
e,n,x
德尔卑沙门氏菌
s.derby
1,4,[5],12
f,g
[1,2]
阿贡纳沙门氏菌
s.agona
1,4,12
f,g,s
埃森沙门氏菌
s.essen
4,12
g,m
加利福尼亚沙门氏菌
s.california
4,12
g,m,t
金斯敦沙门氏菌
s.kingston
1,4,[5],12,27
g,s,t
[1,2]
布达佩斯沙门氏菌
s.budapest
1,4,12,27
g,t
鼠伤寒沙门氏菌
s.typhimurium
1,4,[5],12
i
1,2
拉古什沙门氏菌
s.lagos
1,4,[5],12
i
1,5
布雷登尼沙门氏菌
s.bredeney
1,4,12,27
l,v
1,7
基尔瓦沙门氏菌Ⅱ
s.kilwa Ⅱ
4,12
l,w
e,n,x
海德尔堡沙门氏菌
s.heidelberg
1,4,[5],12
r
1,2
印地安纳沙门氏菌
s.indiana
1,4,12
z
1,7
斯坦利维尔沙门氏菌
s.stanleyville
1,4,[5],12,27
z4,z28
[1,2]
伊图里沙门氏菌
s.ituri
1,4,12
z10
1,5
c1  群
 
 
 
 

奥斯陆沙门氏菌
s.oslo
6,7
a
e,n,x
爱丁堡沙门氏菌
s.edinburg
6,7
b
1,5
布隆方丹沙门氏菌Ⅱ
s.bloemfonteinⅡ
6,7
b
[e,n,x]:z42
丙型副伤寒沙门氏菌
s.paratyphi c
6,7[vi]
c
1,5
猪霍乱沙门氏菌
s.cholerae suis
6,7
[c]
1,5
猪伤寒沙门氏菌
s.typhi suis
6,7
c
1,5
罗米他沙门氏菌
s.lomita
6,7  
e,h
1,5
布伦登卢普沙门氏菌
s.braenderup
6,7
e,h
e,n,z15
里森沙门氏菌
s.rissen
6,7
f,g
蒙得维的亚沙门氏菌
s.montevideo
6,7
g,m,[p],s
[1,2,7]
里吉尔沙门氏菌
s.riggil
6,7
g,t
奥雷宁堡沙门氏菌
s.oranienburg
6,7
m,t
奥里塔蔓林沙门氏菌
s.oritamerin
6,7
i
1,5
汤卜逊沙门氏菌
s.thompson
6,7
k
1,5
康科德沙门氏菌
s.concord
6,7
l,v
1,2
伊鲁木沙门氏菌
s.irumu
6,7
l,v
1,5
姆卡巴沙门氏菌
s.mkamba
6,7
l,v
1,6
波恩沙门氏菌
s.bonn
6,7
l,v
e,n,x
波茨坦沙门氏菌
s.potsdam
6,7
l,v
e,n,z15
格但斯克沙门氏菌
s.gdansk
6,7
l,v
z6
维尔肖沙门氏菌
s.virchow
6,7
r
1,2
婴儿沙门氏菌
s.infantis
6,7
r
1,5
巴布亚沙门氏菌
s.papuana
6,7
r
e,n,z15
巴累利沙门氏菌
s.bareilly
6,7
y
1,5
哈特福德沙门氏菌
s.hartford
6,7
y
e,n,x
三河岛沙门氏菌
s.mikawasima
6,7
y
e,n,z15
姆班达卡沙门氏菌
s.mbandaka
6,7
z10
e,n,z15
田纳西沙门氏菌
s.tennessee
6,7
z29
c2  群
 
 
 
 
习志野沙门氏菌
s.narashino
6,8
a
e,n,x
名古屋沙门氏菌
s.nagoya
6,8
b
1.5
加瓦尼沙门氏菌
s.gatuni
6,8
b
e,n,x
慕尼黑沙门氏菌
s.muenchen
6,8
d
1,2
蔓哈顿沙门氏菌
s.manhattan
6,8
d
1,5
纽波特沙门氏菌
s.newport
6,8
e,h
1,2
科特布斯沙门氏菌
s.kottbus
6,8
e,h
1,5
茨昂威沙门氏菌
s.tshiongwe
6,8
e,h
e,n,z15
林登堡沙门氏菌
s.lindenburg
6,8
i
1,2
塔科拉迪沙门氏菌
s.takoradi
6,8
i
1,5
波那雷恩沙门氏菌
s.bonariensis
6,8
i
e,n,x
利剂菲尔德沙门氏菌
s.litchfield
6,8
l,v
1,2
病牛沙门氏菌
s.bovismorbif-cans
6,8
r
1,5
查理沙门氏菌
s.chailey
6,8
z4,z23
e,n,z15
c3  群
 
 
 
 
巴尔多沙门氏菌
s.bardo
8
e,h
1,2
依麦克沙门氏菌
s.emek
8,20
g,m,s
肯塔基沙门氏菌
s.kentucky
8,20
i
z6
c4  群
 
 
 
 
布伦登卢普沙门氏菌
s.braenderup
6,7,14
e,h
e,n,z15
14+变种
var.14+
耶路撒冷沙门氏菌
s.jerusalem
6,7,[14]
z10
l,w
d  群
 
 
 
 
仙台沙门氏菌
s.sendai
1,9,12
a
1,5
伤寒沙门氏菌
s.typhi
9,12,vi
d
塔西沙门氏菌
s.tarshyne
9,12
d
1,6
伊斯特本沙门氏菌
s.eastbourne
1,9,12
e,h
1,5
以色列沙门氏菌
s.israel
9,12
e,h
e,n,z15
肠炎沙门氏菌
s.enteritidis
1,9,12
g,m
[1,7]
  布利丹沙门氏菌
s.blegdam  
  9,12  
  g,m,q  
  -
沙门氏菌Ⅱ
salmonella Ⅱ
1,9,12
g,m,,t
[1,5]:[z42]
都柏林沙门氏菌
s.dublin
1,9,12[vi]
g,p
芙蓉沙门氏菌
s.seremban
9,12
i
1,5
巴拿马沙门氏菌
s.panama
1,9,12
l,v
1,5
戈丁根沙门氏菌
s.goettingen
9,12
l,v
e,n,z15
爪哇安纳沙门氏菌
s.javiana
1,9,12
l,z28
1,5
鸡-雏沙门氏菌
s.gallinarum-pullorum
1,9,12
e1  群
 
 
 
 
奥凯福科沙门氏菌
s.okejoko
3,10
c
z6
瓦伊勒沙门氏菌
s.vejle
3,10
e,h
1,2
明斯特沙门氏菌
s.muenster
3,10
e,h
1,5
鸭沙门氏菌
s.anatum
3,10
e,h
1,6
纽兰沙门氏菌
s.newlands
3,10
e,h
e,n,x
火鸡沙门氏菌
s.meleagridis
3,10
e,h
l,w
雷根特沙门氏菌
s.regent
3,10
f,g,
[1,6]
西翰普顿沙门氏菌
s.westhampton
3,10
g,s,t
阿姆德尔尼斯沙门氏菌
s.amounderness
3,10
i
1,5
新罗歇尔沙门氏菌
s.new-rochelle
3,10
k
l,w
恩昌加沙门氏菌
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3,10
l,v
1,2
新斯托夫沙门氏菌
s.sinstorf
3,10
l,v
1,5
伦敦沙门氏菌
s.london
3,10
l,v
1,6
吉韦沙门氏菌
s.give
3,10
l,v
1,7
鲁齐齐沙门氏菌
s.ruzizi
3,10
l,v
e,n,z15
乌干达沙门氏菌
s.uganda
3,10
l,z13
1,5
乌盖利沙门氏菌
s.ughelli
3,10
r
1,5
韦太夫雷登沙门氏菌
s.weltevreden
3,10
r
z6
克勒肯威尔沙门氏菌
s.clerkenwell
3,10
z
l,w
列克星敦沙门氏菌
s.lexington
3,10
z10
1,5
e2  群
 
 
 
 
纽因吞沙门氏菌
s.newington
3,15
e,h
1,6
剑桥沙门氏菌
s.cambridge
3,15
e,h
l,w
哈姆斯塔德沙门氏菌
s.halmstad
3,15
g,s,t
朴次茅斯沙门氏菌
s.portsmouth
3,15
l,v
1,6
e4  群
 
 
 
 
萨奥沙门氏菌
s.sao
1,3,19
e,h
e,n,z15
卡拉巴尔沙门氏菌
s.calabar
1,3,19
e,h
l,w
山夫登堡沙门氏菌
s.senftenberg
1,3,19
e,,t
斯特拉特福沙门氏菌
s.stratford
1,3,19
i
1,2
塔克松尼沙门氏菌
s.taksony
1,3,19
i
z6
索恩堡沙门氏菌
s.schoeneberg
1,3,19
z
e,n,z15
f  群
 
 
 
 
昌丹斯沙门氏菌
s.chandans
11
d
e,n,x
阿柏丁沙门氏菌
s.aberdeen
11
i
1,2
布里赫姆沙门氏菌
s.brijbhumi
11
i
1,5
威尼斯沙门氏菌
s.veneziana
11
i
e,n,x
阿巴特图巴沙门氏菌
s.abaetetuba
11
k
1,5
鲁比斯劳沙门氏菌
s.rubislaw
11
r
e,n,x
其  他  群
 
 
 
 
浦那沙门氏菌
s.poona
1,13,22
z
1,6,[z59]
里特沙门氏菌
s.ried
1,13,22
z4,z23
亚特兰大沙门氏菌
s.atlanta
13,23
b
密西西比沙门氏菌
s.mississippi
1,13,23
b
1,5
古巴沙门氏菌
s.cubana
1,13,23
z29
[z37]
苏拉特沙门氏菌
s.surat
[1],6,14,[25]
[r],i
e,n,z15
松兹瓦尔沙门氏菌
s.sundsvall
1,6,14,25
z
e,n,x
非丁伏斯沙门氏菌
s.hvittingfoss
16
b
e,n,x
威斯敦沙门氏菌
s.weston
16
e,h
z6
上海沙门氏菌
s.shanghai
16
l,v
1,6
自贡沙门氏菌
s.zigong
16
l,w
1,5
巴圭达沙门氏菌
s.baguida
21
z4,z23
迪尤波尔沙门氏菌
s.dieuppeul
28
i
1,7
卢肯瓦尔德沙门氏菌
s.luckenwalde
28
z10
e,n,z15
拉马特根沙门氏菌
s.ramatgan
30
k
1,5
阿德莱沙门氏菌
s.adelaide
35
f,g
旺兹沃思沙门氏菌
s.wandsworth
39
b
1,2
雷俄格伦德沙门氏菌
s.riogrande
40
b
1,5
莱瑟沙门氏菌 Ⅱ
s.lethe Ⅱ
41
g,t
达莱姆沙门氏菌
s.dahlem
48
k
e,n,z15
沙门氏菌Ⅲ
salmonella Ⅲ
61
l,v
1,5,7:[z57]
注:本表系根据国内国外常见沙门氏菌整理而成。



三、培养基

  (一)缓冲蛋白胨水
成分:蛋白胨             10g
氯化钠             5g
   磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)  9g
   磷酸二氢钾           1.5g
   蒸馏水             1000mL
pH7.2
按上述成分配好后,装入大烧瓶,121℃高压灭菌,临用时无菌分装每瓶225mL,供沙门氏菌前增菌用。
(二)氯化镁孔雀绿(MM)增菌液
成分:甲液:胰蛋白胨         5g
      氯化钠          8g
      磷酸二氢钾        1.6g
      蒸馏水          1000mL
   乙液:氯化镁(化学纯)      40g
      蒸馏水          100mL
   丙液:0.4%孔雀绿水溶液
制法:分别按上述成分配好,121℃高压灭菌15min备用,临用时取甲液90mL,乙液9mL,丙液0.9mL,以无菌操作混合即可。
(三)四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
成分:多胨或月示胨         5g
   胆盐              1g
   碳酸钙             10g
   硫代硫酸钠           30g
   蒸馏水             1 000mL
制法:将上述各成分加入蒸馏水,加热溶解,分装每瓶100mL中加入碘溶液2mL,0.1%煌绿溶液1mL。
碘溶液配制:碘6g,碘化钾5g,蒸馏水20mL。
(四)亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
成分:蛋白胨           5g
   乳糖            4g
   亚硒酸氢钠          4g
磷酸氢二钠         5.5g
   磷酸二氢钾         4.5g
   L-胱氨酸          0.01g
   蒸馏水           1 000mL
制法:将除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸馏水中,加热煮沸,俟冷备用,另将亚硒酸氢钠溶解于100mL蒸馏水中,加热煮沸,俟冷,以无菌操作与上液混合。再加入1%L~胱氨酸~氢氧化钠溶液1mL。分装于灭菌瓶中,每瓶100mL,pH应为7.0±0.1。
1%L-胱氨酸-氢氧化钠溶液的配法:称取L-胱氨酸0.1g(或DL-胱氨酸0.2g),加1N氢氧化钠1.5mL,使溶解,再加入蒸馏水8.5mL即成。
(五)亚硫酸铋琼脂(BS)
成分:蛋白胨        10g
牛肉膏        5g
葡萄糖        5g
   硫酸亚铁       0.3g
   磷酸氢二钠      4g
   煌绿         0.025g
   柠檬酸铋铵      2g
   亚硫酸钠       6g
琼脂 18~20g
   蒸馏水        1000mL
pH7.5
制法:将前5种成分溶解于300mL蒸馏水中,将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50mL蒸馏水溶解,将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解,冷至80℃,将以上三液合并,补充蒸馏水至1000mL,校正pH,加0.5%煌绿水溶液5mL摇匀,冷至50~55℃倾注平板。
注:此培养基不需高压灭菌,制备过程中不宜过分加热,以免降低其选择性,应在临用前一天制备,贮存于室温暗处,超过48h,不宜使用。
(六)DHL琼脂(Deoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose Agar)
成分:蛋白胨           20g
   牛肉膏           3g
   乳糖            10g
蔗糖            10g
去氧胆酸钠         1g
   硫代硫酸钠         2.3g
   柠檬酸钠          1g
柠檬酸铁铵         1g
   中性红           0.03g
   琼脂            18~20g
   蒸馏水           1000mL
制法:除中性红和琼脂以外的成分溶解于400mL蒸馏水中,校正pH为7.3,再将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解,两液合并,加入0.5%中性红水溶液6mL,待冷至50~55℃倾注平板。
(七)HE琼脂(Hektoen Enteric Agar)
成分:月示胨            12g
   牛肉膏             3g
   乳糖              12g
   蔗糖             12g
   水杨素 2g
   胆盐 20g
   氯化钠 5g
   琼脂              18~20g
   蒸馏水             1000mL
   0.4%溴麝香草酚蓝溶液     16mL
   Andrade指示剂         20mL
 甲液              20mL
乙液              20mL
pH7.5
制法:将前7种成分溶解于400mL蒸馏水内为基础液,将琼脂加入于60mL蒸馏水内,加热溶解,加入甲液和乙液于基础液内,校正pH,再加入指示剂,并与琼脂合并,待冷至50~55℃倾注平板。
注:①此培养基不可高压灭菌。
  ②甲液的配制:
   硫代硫酸钠     34g
   柠檬酸铁铵     4g
   蒸馏水       100mL
  ③乙液的配制:
   去氧胆酸钠     10g
   蒸馏水       100mL
  ④Andrade指示剂:
   酸性复红       0.5g
1N氢氧化钠溶液   16mL
   蒸馏水       100mL
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液,数小时后中复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1~2mL。
(八)SS琼脂
1. 基础培养基
成分:牛肉膏         5g
   月示胨        5g
   三号胆盐        3.5g
   琼脂          17g
   蒸馏水         1000mL
制法:将牛肉膏、月示 胨和胆盐溶解于400mL蒸馏水中,将琼脂加入于600mL蒸馏水中,煮沸,使其溶解,再将两液混合,121℃高压灭菌15min,保存备用。
2. 完全培养基
成分:基础培养基       1000mL
   乳糖          10g
   柠檬酸钠        8.5g
   硫代硫酸钠       8.5g
   10%柠檬酸铁溶液    10mL
   1%中性红溶液      2.5mL
0.1%煌绿溶液      0.33mL
制法:加热溶化基础培养基,按比例加入上述染料以外的各成分,充分混合均匀,校正pH至7.0,加入中性红和煌绿溶液,倾注平板。
注:① 制好的培养基宜当日使用,或保存冰箱内于48h内使用。
  ② 煌绿溶液配好后应在10d以内使用。
  ③ 可以购用SS琼脂的干燥培养基。
(九)三糖铁琼脂
成分:蛋白胨:         20g
   牛肉膏          5g
乳糖           10g
蔗糖           10g
   葡萄糖          1g
   氯化钠          5g
   硫酸亚铁铵[Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O]0.2g
   硫代硫酸钠           0.2g
   琼脂              12g
   酚红              0.025g
   蒸馏水             1000mL
pH7.4
制法:将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中,校正pH,加入琼脂煮沸溶化,加入0.2%酚红水溶液12.5mL,摇匀,分装试管,121℃高压灭菌15min,放置高层斜面备用。
(十)蛋白胨水(靛基质试验用)
万分:蛋白胨(或胰蛋白胨)      20g
   氯化钠             5g
   蒸馏水             1000mL
pH7.4
制法:按上述成分配制,分装小试管,121℃高压灭菌15min。
靛基质试剂:
 柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醛溶于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。
欧-波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%酒精内,然后缓慢加入浓盐酸20mL。
试验方法:接种培养物36±1℃培养1~2d,加柯凡克试剂约0.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色。或加欧-波试剂约0.5mL,沿管壁下覆盖于培养基表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注:蛋白胨中应含有丰富的色氨酸,每批蛋白胨应先用已知菌种鉴定后方可使用。
(十一)尿素琼脂(pH7.2)
成分:蛋白胨        1g
   氯化钠        5g
   葡萄糖        1g
   磷酸二氢钾      2g
   0.4%酚红溶液     3mL
   琼脂         20g
   蒸馏水        1000mL
   20%尿素溶液     100mL
pH7.2
制法:将除尿素和琼脂以外的成分配好,校正pH,加入琼脂煮沸溶化,分装烧瓶,121℃高压灭菌15min,冷至50~55℃加入经除菌过滤的尿素溶液,分装于灭菌试管内,放成斜面备用。
试验方法:接种培养物36±1℃培养24h,观察结果,尿素酶阳性者,由于产碱而使培养基变为红色。
(十二)氰化钾(KCN)培养基
成分:蛋白胨         10g
氯化钠         5g
   磷酸二氢钾       0.225g
磷酸氢二钠 5.64g
   蒸馏水         1000mL
   0.5%氰化钾溶液    20mL
           pH7.6
制法:将除氰化钾以外的成分配好,分装烧瓶,121℃高压灭菌15min,放在冰箱内使用其充分冷却,每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2mL(最后浓度为1:10000),分装灭菌试管,每管约4mL,立刻用灭菌橡皮塞塞紧,放4℃冰箱保存,同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
(十三)氨基酸脱羧酶试验培养基
成分:蛋白胨           5g
酵母浸膏          3g
   葡萄糖 1g
蒸馏水           1000mL
   1.6%溴甲酚紫乙醇溶液    1mL
   L-氨基酸或DL氨基酸     0.5或1g/100mL
制法:除氨基酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入各种氨基酸:赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入,DL-氨基酸按1%加入,校正pH至6.8,对照培养基不加氨基酸,分装于灭菌的小试管内,每管0.5mL,上面加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。
试验方法:接种培养物于36±1℃培养18~24h,观察结果,氨基酸脱羧酶阳性者,由于产碱培养基应呈绿色,阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色,对照管应为黄色。
(十四)糖发酵管
成分:牛肉膏          5g
   蛋白胨          10g
   氯化钠          3g
磷酸氢二钠        2g
   0.2%溴麝香草酚蓝溶液   12mL
   蒸馏水          1000mL
            pH7.4
制法:葡萄糖发酵管按上述成分配好后,按0.5%加入葡萄糖,分装于有倒管的试管内,121℃高压灭菌15min。其他各种糖发酵管,可按上述成分配好后分装好后分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min,另将各种糖类分别配成10%溶液,同时高压灭菌,将5mL糖溶液加入于100mL培养基内,以无菌操作分装小试管。
注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
(十五)ONPG培养基
成分:邻硝基酚β-D半乳糖苷(O~nitrophenyl
   β-D-galactopyranoside ONPG)    60mg
   0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)   10mL
   1%蛋白胨水(pH7.5)        30mL
制法:将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装试管,每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。
试验方法:由琼脂斜面上挑取培养物1满环接种,于36±1℃培养1-3h或24h观察结果,如果β-半乳糖苷酶产生,由于1-3h变黄色,如无此酶则24h不变色。
(十六)半固体琼脂
成分:蛋白胨          1g
   牛肉膏          0.3g
   氯化钠          0.5g
   琼脂           0.35~0.4g
   蒸馏水          100mL
制法:按上述成分配好,煮沸溶解,校pH为7.4,分装小试管,121℃高压灭菌15min,直立疑固备用。
(十七)缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和V-P试验用)
成分:磷酸氢二钾        5g
   多胨           7g
   葡萄糖          5g
   蒸馏水          1000mL
           pH7.0
制法:溶化后校正pH,分装试管,每管1~2mL,121℃高压灭菌15min。
甲基红试验:接种培养物于36±1℃培养2~4天,滴加试剂一滴,立即观察结果,鲜红色为阳性,黄色为阴性。
甲基红试剂配法:10mg甲基红溶于30mL乙醇中,然后加入20mL蒸馏水。
V-P试验:接种培养物于36±1℃培养2~4天,加入6%α-萘酚酒精溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇观察结果,阳性者立刻或数分钟呈红色,如阴性时应于36℃培养4h再进行观察。
(十八)丙二酸钠培养基
成分:酵母膏          1g
   硫酸铵          2g
   磷酸氢二钾        0.6g
   磷酸二氢钾        0.4g
   氯化钠          2g
   丙二酸钠         3g
   0.2%溴麝香草酚蓝溶液   12mL
   蒸馏水          1000mL
            pH6.8
制法:先将酵母浸膏和盐类溶解于水,校正pH后再加指示剂,分装试管,121℃高压灭菌15min。
接种培养物于36±1℃培养48h,阳性者由绿色变为蓝色。
(十九)氧化酶试验
1%盐酸二甲基对苯二胺溶液:小量新鲜配制,于冰箱内避光保存。
1%α-萘酚乙醇溶液。
试验方法:取白色洁净滤纸沾取菌落,加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴,阳性者呈现粉红色,并逐渐加深,再加α-萘酚溶液一滴,阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色,阴性于2min内不变。
以毛细吸管吸取试剂,直接滴加于菌落上,其显色反应与以上相同。
(二十)WS琼脂
成分:
  月示胨            12g
  牛肉膏              3g
  氯化钠              5g
  乳糖               12g
  蔗糖               12g
  十二烷基硫酸钠          2g
  琼脂               15g
  Andrade指示剂           20mL
  0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16mL
  甲液               20mL
  蒸馏水              1000mL
              pH7.0
制法:
除指示剂和甲液外,将其他成分加热溶解,不需消毒,校正pH后加入指示剂和甲液,倾注平板,应呈草绿色。
注:①供沙门氏菌分离用。
  ②Andrade指示剂和甲液的配制均见HE琼脂。


沙门氏菌参考检验方法

一、肠杆菌噬菌体分属诊断方法
1978~1986年间,由江西省卫生防疫站和南昌市医学科学研究所,共同建立了肠杆菌科分属诊断噬菌体,是供沙门氏菌属、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌属,弗劳地氏柠檬酸杆菌和阴沟杆菌鉴定用的配套噬菌体(包括沙门氏菌噬菌体O-1,弗劳地氏柠檬酸杆菌噬菌体C(фⅠ和фⅢ)、噬菌体CE(фⅡ和E-3)、大肠埃希氏噬菌体E(E-1和E-2)、大肠埃希氏菌噬菌体E-4,阴沟肠杆菌噬菌体Ent)。

二、肠杆菌科分属诊断噬菌体应用于沙门氏菌诊断方法
(一)标本按常规方法进行前增菌和增菌后,划线接种于鉴别平板,于37℃培养过液,挑取可疑菌落于2mL胨水管内,使每毫升含菌约50~100万个。
(二)将备好的营养琼脂平板在37℃烘干表面水分,使具有较好的吸水性,用灭菌棉签将菌液在已烘干的琼脂平板上涂抹。

(三)待平板上菌液干后,用配有 号针头的滴管(每毫升约100滴)依次滴加噬菌体。其顺序为O-1,C,Sh,E,CE,E-4,Ent。
(四)平板稍干后于37℃培养6h和过夜,观察结果,按下表判定菌属。必要时做靛基质试验。
表3-9 肠杆菌科诊断噬菌体简化诊断表
序号
噬菌体裂解模式
判定结果
 
O-1
c
sh
e
ce
e-4
ent
 
1
2
 
3
4
5
6
 
7
8
0
cl
cl
 


·

 




 
cl



 

(-)


 

cl


 

·


 

·
cl

 




 
(-)
·
·
cl
 
·


cl
 
(-)
·
·

 
cl



 




 

cl
沙门氏菌属
沙门氏菌属(靛基质一)
大肠埃希氏菌(靛基质十)
弗劳地氏柠檬酸杆菌
志贺氏菌属,大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌
弗劳地氏柠檬酸杆菌,大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌
阴沟肠杆菌
噬菌体阴性菌株(用生化试验方法鉴定)
注:CL融合性裂解;-不裂解;·裂解或不裂解;(一)很少菌体裂解。


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